消失的少年：胡鑫宇神秘失踪后的86天

 1月7日，江西警方发布铅山县致远中学15岁高中生胡鑫宇失踪事件调查进展情况的通报。

通报称，公安机关高度重视，去年10月15日接到报警后即组织开展调查搜寻工作，未发现胡鑫宇在校内被害、自杀、发生意外的痕迹证据。综合现有信息指向胡鑫宇系自行离校，目前正在全力查找中。

2022年10月14日，15岁少年胡鑫宇在学校神秘失踪，只留下一段宿舍门口的监控画面。截至目前，他已经消失了86天。

消失的少年

去年9月，江西铅山县少年胡鑫宇考入致远中学，并获得了学校奖励的1500元奖金。据江西省上饶市公安机关2023年1月7日发布的通报称，胡鑫宇就读致远中学后，多科测试成绩在班级排名中下，本人曾向老师同学表示学习吃力、压力大，注意力难以集中，存在睡眠问题、休息不好，想回家。胡鑫宇曾多次在书本、笔记本上写下了失眠、失落、想回家等文字内容。

胡鑫宇妈妈李女士接受九派新闻采访时表示，入学后自己仅与儿子通过两次电话。第一次是在9月27日，胡鑫宇主动给她打了电话。“妈妈，我有点儿想哭。”在这次通话中，胡鑫宇表露出心情沮丧，李女士追问过原因，并未得到回答。胡鑫宇与妈妈的第二次通话是在10月9日，这也是李女士与儿子的最后一次通话。此次通话是因为快递到了，胡鑫宇需要打电话给哥哥。

据李女士回忆，胡鑫宇是一个懂事、话不多、喜欢和朋友一起跑跑步、偶尔和自己开开玩笑的人。李女士提到，自己曾问儿子是否需要陪读，胡鑫宇对她说：“妈妈，我不要你陪读，如果需要的话，就等到明年。”

上述通报还表示，去年国庆节前，胡鑫宇与同学聊天时曾谈论可以从睢园围墙一角翻越出校等内容。10月11日地理测试成绩公布胡鑫宇排名全班末位。10月12日、13日，胡鑫宇曾多次到宿舍楼三楼阳台观望睢园及校外树林山岗方向，并邀请同学去睢园。10月14日，胡鑫宇上课时总是低着头，看着课本发呆。

另据10月14日视频监控显示及调查证实，胡鑫宇下午下课后到食堂用餐，晚餐后17时40分独自回到306寝室短暂停留，后上到五楼阳台停留2分57秒，往睢园和校外树林山岗方向张望；

17时45分走出宿舍楼，打篮球的同学与其简单对话，监控显示其往睢园方向走去；

17时49分胡鑫宇再次返回宿舍楼，未回寝室，17时50分到达五楼阳台停留13秒；

17时51分30秒胡鑫宇从宿舍楼走出后，打篮球的同学再次与其打招呼，并看到其走上睢园台阶；

17时51分58秒在睢园方向离开视频监控范围之后再未发现胡鑫宇轨迹。

家属的疑惑

胡鑫宇失联后，包括江西省公安厅、上饶市公安局、铅山县公安局三级警方均介入调查。

去年11月11日上午，胡鑫宇父母、舅舅及另外一名亲戚4人来到其律所，要求律师为他们代书，撰写控告信。控告信标题是《疑似江西校园埋尸案，请求刑事立案侦查》，要求事项包括三点：第一，请求铅山县公安局立即对胡鑫宇涉嫌校园被害案进行刑事立案侦查；第二，请求铅山县人民检察院对胡鑫宇涉嫌校园被害案立案监督；第三，请求上饶市公安局对胡鑫宇涉嫌校园被害案进行督查，必要时指定异地公安管辖。

2023年元月1日上午9点左右，当地警方和胡鑫宇亲属就最新的调查情况进行了会见沟通。据媒体披露，对于胡鑫宇的失踪，在这次会谈内容中，其实并没有实质性进展。

按照警方的说法，他们对胡鑫宇周边人士进行了走访，有学校老师亲友等，形成了大量的笔录。警方表示，胡鑫宇可能是有厌学情绪，自行出走了，但目前尚未发现孩子的具体去向和下落；

对于家属质疑学校监控视频被删减，警方称通过监控的设备生产商海康威视技术人员鉴定，表明视频未被删减；

针对网络流传的众多猜测，如胡鑫宇消失与学校老师相关，被车辆带出学校等说法，警方称已经逐一排查，未发现有价值的线索；

另外，警方还认为，关于胡鑫宇的失联，目前排除了学校相关人员的犯罪嫌疑。

1月5日，胡鑫宇妈妈通过视频发声，恳请立案，“我家鑫宇在学校被害，我恳请公安恳请政府要立案，我孩子不是送去学校送命的呀！”

张文宏最新演讲，呼吁怎么挽救老年人

 据上观新闻8日报道，我国新冠疫情的未来发展趋势如何？怎样挽救更多老年人等脆弱人群的生命？昨天举行的第二届光华论坛上，国家传染病医学中心主任、复旦大学附属华山医院感染科主任张文宏教授作了主题演讲。在他看来，中国进入大规模流行第一波后，将逐渐进入地方性流行阶段，与世界“同步”。

在从大规模流行到地方性流行的转化期，他呼吁尽快根据各省市摸底的高危因素人群基数，完成药物储备。“如果能对100%高危因素患者覆盖抗病毒药物，将有效降低具有高危因素人群的重症率。”他还呼吁：尽快将60岁以上老年人疫苗全程接种率提升至90%。

“我相信，中国具备把新冠疫情变成地方性流行的能力。”张文宏说。论坛主持人、复旦大学教授卢大儒表示：“张主任的演讲坚定了大家的抗疫信心。”

张文宏：我国具备把疫情转变为地方性流行的能力

在应对疫情第一波冲击的优化防控应对方案中，做好药物储备工作也非常重要。目前，抗新冠病毒药物已进入多管线竞争局面，paxlovid（奈玛特韦/利托那韦）、阿兹夫定、莫诺拉韦、单克隆抗体、静注covid-19人免疫球蛋白，给脆弱人群的临床救治带来了多种选择。此外，托珠单抗、巴瑞替尼等抗炎症药物也已到位。

当前，相关部门应根据各省市摸底的高危因素人群基数，尽快完成药物储备。“基层要有药可用，这样才能防止二级、三级医疗资源挤兑。”张文宏说。

各地还要加强三级分级诊疗体系，包括：社区街道行政体系与社区卫生服务中心联动，为无症状和轻症患者做好居家康复诊疗管理；发热门诊筛查出需要到定点医院的高危人群，及时救治转诊；引入信息化与远程医疗系统。

张文宏表示，在感染者起病后的“黄金72小时”内，社区卫生服务中心要充分用好抗病毒小分子药物，同时可采用氧疗、中药和低剂量的激素治疗。“中药会给中国人带来额外的辅助疗效。”

中国内地如今已进入了大流行高峰期第一波，随着医疗资源的逐步到位，我们将过渡到地方性流行阶段。“最终的结果很可能是全球趋同，就像流感一样，成为季节性流行病。”张文宏说，“当然，新冠病毒今后是否会出现大的变异，使人群缺乏预存免疫，还需要科学家未来进行严密监测。”

张文宏：当下抗击新冠主战场在“基层”

据澎湃新闻报道，最近一周，国家传染病医学中心主任、复旦大学附属华山医院感染科主任张文宏先后前往上海闵行、杨浦、静安，多次与社区卫生服务中心医护人员进行交流，对基层医疗机构的新冠病毒感染救治工作开展调研指导及培训。

张文宏教授介绍了当前有效救治新冠病毒感染的医疗方法，并就基层救治作专题培训。他表示，当下抗击新冠病毒感染的主战场在“基层”，社区家庭医生对辖区内重点人群要尽快采取介入治疗手段，对慢性基础疾病患者做好分类筛查、建立台账、摸清底数。社卫中心要根据新冠治疗指南，抓住新冠病毒感染患者的“黄金72小时”，早发现、早干预、早治疗，确保轻症患者得到及时救治。张文宏提出，对病情加重的患者应立即启动分级诊疗机制，及时阻断65岁以上重点人群的重症发展概率。各社卫中心要充分发挥分级诊疗前沿阵地的优势，有效缓解二三级医疗机构的就诊高峰，防止医疗挤兑，切实发挥起基层“网底”作用。

据第一财经报道，复旦大学华山医院感染科主任张文宏日前在一场内部培训会上这样表示,“社区医院是新冠患者救治的第一道关口，只要用对了救治方案，我认为绝大多数患者都能在‘黄金72小时’内得到缓解，进而防止由轻症转向重症。”

张文宏强调，在这宝贵的3天里，首先应该将新冠抗病毒小分子药物用下去，“当前，二级和三级医院的床位周转一定是慢的，早期的轻症患者辗转于大医院排队、就诊、吊水，反而可能会延误、加重病情。在治疗的初期，在没有合并细菌感染时，一定要对症下药。”

“其次，为了防止轻症转重症，一旦检测到患氧饱和度有所下降，那一定是肺部功能出现了问题，可以配合用一定的激素，“我们社区医生也不用过度担心激素使用、或者血糖控制等问题。激素是目前为止在轻症向重症转化的高危人群中明确有效的药物，而胰岛素、口服降糖药等也能在监测下同步使用。”

张文宏建议，患者不必全部去二级、三级医院挂水，“可以在二级医院将补液配好，回到社区医院输液，再结合社区医院开具的抗病毒药物即可。”他举例，“比如，一位轻症新冠患者，如果没有合并细菌感染的话，第一天，可以在补液里加少量的地米塞松，同时在社区医院吸氧。可能1个多小时后，他的热度就会下降、氧饱和度也会改善，晚上回去再补充些蔬菜、盐分和炖蛋，人的状态也会好很多。随后第二、三天，可以根据患者状况陆续减少药品剂量，或者输液改成口服等。”

除了张文宏，还有多名医生表示，要尽早用抗病毒治疗药物。

miRNA 在基因调控中的作用

 近年来，lncRNA、circRNA、miRNA 相关研究的话题相当火热，哟呵，小小 RNA 的花样儿还不少，它们与小分子化合物又能碰撞出什么样的火花呢？

MicroRNA (miRNA) 是什么？“micro”“mi”是微小的意思，顾名思义，miRNA 就是小的非编码 RNA，长度约 23 个核苷酸 (nt)，它在转录后的基因调控中发挥关键作用，包括疾病的发生、细胞分化与组织发育，细胞凋亡等等。

miRNA 的生物发生及在疾病中的作用

miRNA 从哪儿来：一般而言，在细胞核内，通过 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录生成初始 miRNA (pri-miRNA)，长约几百到几千个碱基不等。pri-miRNA 主要包括帽子结构和 poly(A)，以及一个或多个发夹茎环结构 (Stem-loop) →→ 被 RNA 结合蛋白 DGCR8 高效特异性识别，并在 Drosha 蛋白的作用下，被切割成 ~70 nt 的茎环结构，即 miRNA 的前体 (pre-miRNA) →→ 在输出蛋白 Exportin5 的作用下运输到细胞质中，在 RNA 酶 Ⅲ 内切酶 Dicer 和 TRBP（反式激活应答 RNA 结合蛋白）伴侣的作用下形成 19-23 nt 左右的成熟双链 miRNA 结构 (引导链 miRNA 和随从链 miRNA*)  →→与 Argonaute (Ago) 蛋白和 Dicer 酶一起构成 RNA 诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)，其中随从链 miRNA* 被移除，从而形成单链的 miRNA。 miRNA 要到哪儿去：miRNA 的种子区域 (5’ 端的 2-8 nt) 通过序列互补原则靶向 mRNA，可直接抑制翻译，或可导致 mRNA 不稳定，从而降解靶蛋白。 (Ago 是 miRNA 的得力助手和保镖，miRNA 调控靶蛋白需要通过 Ago 实现，Ago 还保护了 miRNA 不被降解。以 hAgo 为例，hAgo 有四个亚型 hAgo1-hAgo4，Ago 通过 miRNA 的引导，定位到靶 mRNA 的互补区域，hAgo2 通过固有的内切核酸裂解活性来使 mRNA 沉默。或者更典型地，通过抑制翻译，以及诱导 mRNA 降解来发挥作用。)

图 1. miRNA 的生物发生过程[2]

作为最早发现、名字都很独树一帜的 miRNA，let-7 一直以来都是 miRNA 研究中的常客，let-7 是个抑癌因子 (通过下调 MYC、HMGA2、BLIMP1 或者 RAS 家族成员，抑制肿瘤的发展)，降低了癌症的侵袭性、化疗抗性和放射抗性 (极少数情况下，也可能作为一个原癌基因)。此外，let-7 还在诸多癌症中差异性表达，有望成为肿瘤筛选的标记物。 另一个流量明星——miR-210，是一个原癌 miRNA，在多种癌细胞中表达显著升高，如胰腺癌、乳腺癌。研究发现，沉默 miR-210-3p 可以显著抑制临床前模型中前列腺癌细胞的骨转移，miR-210-3p 通过靶向 NF-κB 信号通路的负调控因子 TNIP1 和  SOCS1 促进 EMT (间充质转化)、侵袭和迁移，导致 NF-κB 通路的激活。此外，miR-210 是低氧诱导因子的一个重要靶点，已有研究证实，高水平的 miR-210 和体内缺氧信号有关。

RNA 的二级结构也可成为小分子靶点？

第一个靶向 miRNA 的小分子得追溯到 2008 年，Shan 等人通过荧光标签筛选 FDA 库，发现依诺沙星 (Enoxacin) 可增强 siRNA 介导的 mRNA 降解，能促进内源性 miRNAs 的生物发生，该作用依赖于 TRBP 途径。但因 miRNA 的特殊性，不少小分子都是靶向 AGO、TRBP 等调控 miRNA 生物发生的关键分子，而非直接靶向。可喜的是，近年，研究人员发现了可靶向 RNA 二级结构的小分子。 2017 年，Matthew G. Costales 等人发现了 miR-210 的一个靶向小分子 Targapremir-210 (TGP-210)，TGP-210 选择性的识别 miR-210 前体 pre-miRNA，并结合到该前体结构的 Dicer 位点，抑制 miRNA 的成熟，从而解除 miR-210 对缺氧相关蛋白 GPD1L 活性的抑制，引发一系列的生物学反应。

图 2. TGP-210 的作用机制[7]

TGP-210 在纳摩尔级别就具有明显的促乳腺癌细胞凋亡作用，并通过 anti-miR-210 antagomir (miR-210 拮抗剂) 阳性对照实验发现，TGP-210 和 miR-210 拮抗剂具有相似的生物活性和特异性。 (TGP-210 和 miR-210 拮抗剂均影响成熟 miR-210 的表达水平，TGP-210 对其它  ~2500 个 miRNA 无明显活性。另外贴心地给大家比对了人、小鼠和大鼠的 pre-miR-210 的序列，发现其成熟 miRNA 序列完全一致，pre-miRNA 序列的同源性也高达 96.6%。)

图 3. 不同物种 pre-miR-210 的序列比对 （来自数据库 miRBase）

此外，在小鼠三阴性乳腺癌 (TNBC) 模型中，TGP-210 和 miR-210 拮抗剂均显著抑制了肿瘤生长，且 TGP-210 单次腹腔注射可维持肿瘤抑制 21 天。这些结果说明，能折叠成确定的二级结构，但三级结构有限的 RNA 也可以作为小分子的靶标，且小分子抑制剂显示出了意想不到的特异性。

TGP-210 的 2.0 版本——核糖核酸酶靶向嵌合物 (RIBOTAC)

研究不止步于此，Matthew G. Costales 团队在 2018 年报道，2’-5’ poly(A) 寡核苷酸偶联在 miR-96 的发夹前体结构上，可局部激活内源性的核糖核酸酶 (RNase L)，在细胞中选择性切割 miR-96 的前体。miR-96 的沉默可以抑制促进 FOXO1 降解的转录因子，从而触发癌细胞的凋亡。无独有偶，该团队在 2020 年报道了 TGP-210 的后续研究，作者将不同单位的 2’-5’ poly(A) (1-4) 寡核苷酸偶联到 TGP-210  上，发现 TGP-210-RL (连接 4 个单位的 2’-5’A) 具有很好的切割活性 (RIBOTAC)。

图 4. TGP-210 和 TGP-210-RL 的结构式比较[10]

TGP-210 可结合 pre-miRNA (Kd = 160 nM)，但也能结合 DNA (Kd = 620 nM)，而优化后的 TGP-210-RL 与 DNA 的结合活性大大降低 (Kd = 1200 nM)，且具有更高的特异性，但其与 pre-miRNA 的结合活性也有所降低 (Kd = 320 nM)。 (Dicer 位点发生单碱基突变后，无法与 TGP-210-RL 结合。) 尽管有寡核苷酸的存在，TGP-210-RL 还是可以自如地进入细胞发挥作用 (进入数量是 TGP-210 的 60%)，与 TGP-210 主要定位于细胞核不同，TGP-210-RL 主要存在于细胞质。TGP-210 和 TGP-210-RL 均可以显著下调成熟 miRNA 的水平。TGP-210-RL 同时显著下调 pre-miR-210 的水平，这是 TGP-210-RL 激活的 RNase L 选择性切割 pre-miR-210 的结果。和阳性对照 LNA-210 相比，TGP-210 和 TGP-210-RL 均可引起相似的癌细胞凋亡作用，且 TGP-210-RL 活性更好。 (TGP-210 会导致 pre-miR-210 的水平升高，这与其机制是一致的。过表达 miR-210 后，LNA-210、TGP-210 和 TGP-210-RL 的凋亡作用均消失，进一步验证了癌细胞凋亡是由抑制 miR-210 导致的。) 2020 年 12 月 Science 报道了 miRNA 靶向降解 (TDMD) 的新机制，研究发现 ZSWIM8 Cullin-RING E3 蛋白酶体途径靶向降解 Ago，使大量 miRNA 暴露降解。这一发现不仅为开发 miRNA 的降解剂提供了新思路，也拉近了 miRNA 和小分子药物的距离。 小编寄语：传统意义上认为的 RNA 难以靶向、药物筛选成本巨大等问题，常常使得 RNA 靶向小分子被忽略。但是 Matthew G. Costales 团队的研究给了我们新启示，一方面 Inforna 的计算程序可更好的评估小分子靶向 RNA 的选择性和靶向性，另一方面，核糖核酸酶靶向嵌合物（TGP-210-RL，RIBOTACs）也实现了新突破。2020 年 12 月，该团队又又又开发出了pre-miR-21 的小分子抑制剂 TGP-21 和 RIBOTAC TGP-21-C1-3，真是高效的团队，这速度小编实在望尘莫及。

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参考文献

1. Hongyu Liu, et al. Nuclear functions of mammalian MicroRNAs in gene regulation, immunity and cancer. Mol Cancer. 2018 Feb 22; 17(1): 64.

2. Dónal O'Carroll, et al. General principals of miRNA biogenesis and regulation in the brain. Neuropsychopharmacology. 2013 Jan; 38(1): 39-54.

3. Jessica Sheu-Gruttadauria, et al. Structural Basis for Target-Directed MicroRNA Degradation. Mol Cell. 2019 Sep 19; 75(6): 1243-1255. e7.

4. Evgeny Chirshev, et al. Let-7 as biomarker, prognostic indicator, and therapy for precision medicine in cancer. Clin Transl Med. 2019 Aug 28; 8(1): 24.

5. Rengen Fan, et al. Small molecules with big roles in microRNA chemical biology and microRNA-targeted therapeuticsRNA Biol. 2019 Jun; 16(6): 707-718.

6. Dong Ren, et al. Oncogenic miR-210-3p promotes prostate cancer cell EMT and bone metastasis via NF-κB signaling pathway. Mol Cancer. 2017 Jul 10; 16(1): 117.

7. Matthew G Costales, et al. Small Molecule Inhibition of microRNA-210 Reprograms an Oncogenic Hypoxic Circuit J Am Chem Soc. 2017 Mar 8; 139(9): 3446-3455.

8. Ge Shan, et al. A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8): 933-40.

9. Matthew G Costales, et al. Small Molecule Targeted Recruitment of a Nuclease to RNA. J Am Chem Soc. 2018 Jun 6; 140(22): 6741-6744.

10. Matthew G Costales, et al. Targeted Degradation of a Hypoxia-Associated Non-coding RNA Enhances the Selectivity of a Small Molecule Interacting with RNA. Cell Chem Biol. 2019 Aug 15; 26(8): 1180-1186. e5.

11. Charlie Y Shi, et al. The ZSWIM8 ubiquitin ligase mediates target-directed microRNA degradation. Science. 2020 Dec 18; 370(6523):eabc9359.

12. Matthew D Disney, et al. Inforna 2.0: A Platform for the Sequence-Based Design of Small Molecules Targeting Structured RNAs. ACS Chem Biol. 2016 Jun 17; 11(6): 1720-8. 

13. Blessy M Suresh, et al. A general fragment-based approach to identify and optimize bioactive ligands targeting RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Dec 29;117(52):33197-33203

细胞迁移实验技术之Transwell Assay

 细胞迁移实验技术

—Transwell Assay

Transwell间接

trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0 μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

Transwell小室结构示意图

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

programmatic message sending

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The Gmail API is a RESTful API that can be used to access Gmail mailboxes and send mail. For most web applications the Gmail API is the best choice for authorized access to a user's Gmail data and is suitable for various applications, such as:

• Read-only mail extraction, indexing, and backup
• Automated or programmatic message sending
• Email account migration
• Email organization including filtering and sorting of messages
• Standardization of email signatures across an organization